Gradiente per sezionare il flusso di lavoro CUBE per la generazione e l'imaging di organoidi con differenziazione localizzata

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 299 (2023) Citare questo articolo

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I progressi nella coltura degli organoidi hanno portato a vari mini-organi in vitro che imitano i tessuti nativi in ​​molti modi. Tuttavia, il collo di bottiglia rimane quello di generare organoidi complessi con uno schema dell’asse corporeo, oltre a mantenere l’orientamento degli organoidi durante i processi di analisi post-esperimento. Qui presentiamo un flusso di lavoro per la coltura di organoidi con gradiente di morfogeno utilizzando un dispositivo di coltura CUBE, seguito dal sezionamento dei campioni con il CUBE per conservare le informazioni sulla direzione del gradiente. Mostriamo che gli sferoidi hiPSC coltivati ​​con due mezzi di differenziazione separati sulle estremità opposte del CUBO hanno prodotto espressioni localizzate dei rispettivi marcatori di differenziazione, in contrasto con la distribuzione omogenea dei marcatori nei controlli. Descriviamo anche i processi per il sezionamento criogenico e in paraffina degli sferoidi in CUBE per conservare le informazioni sull'orientamento del gradiente. Questo flusso di lavoro, dalla coltura in gradiente al sezionamento con CUBE, può fornire ai ricercatori uno strumento utile per generare organoidi sempre più complessi e studiarne i processi di sviluppo in vitro.

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) e gli organoidi da esse derivati ​​offrono un modo pragmatico per modellare e studiare la formazione di tessuti e organi durante le prime fasi dello sviluppo umano, poiché i campioni reali pongono questioni etiche impegnative1,2,3,4. I protocolli per generare i vari organoidi che imitano i tessuti nativi generalmente si basano sulla manipolazione sequenziale dell'attivazione o dell'inibizione di percorsi di segnalazione come Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt o BMP in diversi punti temporali per indurre la differenziazione verso lignaggi specifici, come nel generazione di organoidi intestinali5, renali6 e polmonari7, epiblasti8,9 e gastruloidi10.

Tuttavia, il controllo della crescita e della differenziazione delle cellule lungo un asse corporeo rimane una sfida nelle colture di organoidi 3D. In vitro, il modello antero-posteriore e dorso-ventrale negli organoidi può derivare dall'autorganizzazione cellulare11,12 o ottenuto fondendo insieme organoidi differenziati separatamente come un assembloide come negli organoidi cerebrali con diverse regioni cerebrali o negli organoidi biliari con fegato, organi biliari componenti del tratto e del pancreas13,14. Il limite di questi metodi, tuttavia, è che, poiché le cellule vengono coltivate in un unico mezzo uniforme, il livello di controllo in termini di informazioni spaziali fornite alle cellule è piuttosto basso; tutte le cellule all'interno del gruppo di cellule che compongono l'organoide ricevono gli stessi segnali di differenziazione dalle molecole di segnalazione nel mezzo. In vivo, d'altra parte, anche i gradienti di concentrazione di morfogeni provenienti da altre fonti contribuiscono a determinare dove vanno le cellule e quale fenotipo o modello dovrebbero adottare durante lo sviluppo15,16. Ad esempio, la formazione del tubo neurale dipende dai segnali provenienti dalla notocorda e dallo strato ectodermico non neurale17, mentre i nefroni del rene si sviluppano mediante lo scambio di vari segnali tra la gemma ureterale e il mesenchima metanefrico18. Pertanto, è necessario replicare i gradienti morfogenici per generare organoidi che assomiglino più da vicino ai tessuti nativi in ​​vivo.

Sono state sviluppate diverse tecnologie ingegneristiche per imitare la fornitura del gradiente spaziale di molecole di segnalazione alle cellule in vitro. Le PSC progettate per esprimere Sonic Hedgehog (Shh)19 o perline di agarosio imbevute di morfogeni20 possono essere posizionate vicino all'organoide in via di sviluppo e la diffusione delle molecole dalla sorgente alle cellule in differenziazione ha creato un gradiente di concentrazione da alto a basso di morfogeni. Inoltre, sono stati sviluppati vari transwell e microdispositivi modificati che consentono la coltura delle cellule con due compartimenti separati per generare gradienti morfogenici in direzioni opposte attraverso le cellule21,22,23,24,25,26. Tuttavia, queste tecnologie non sono prive di inconvenienti: (1) richiedono complicate procedure di preparazione e installazione che non sono facili da eseguire nella maggior parte dei laboratori di biologia senza competenze e attrezzature specialistiche, (2) mancano di controllo sul posizionamento e sul posizionamento dei campione nel dispositivo e (3) è difficile recuperare il campione dal dispositivo dopo l'esperimento per ulteriori analisi senza causare molti danni al campione o perdere l'orientamento del campione. In particolare, la capacità di conservare informazioni sull'orientamento del gradiente a cui erano soggette le cellule è fondamentale per garantire un'analisi corretta del campione.